:: Kasetsart University ::

หน้าแรก > งานวิจัย > พริกจำลองพันธุ์ที่ต้านทานไวรัส

พริกจำลองพันธุ์ที่ต้านทานไวรัส

พิสสวรรณ เจียมสมบัติ

บทนำ

พริกเป็นพืชผักเศรษฐกิจที่สำคัญยิ่งสำหรับบริโภคภายในประเทศ รวมทั้งส่งออกไปต่างประเทศ มีมูลค่าผลผลิตรวมทั้งพริกสด พริกแห้ง และผลิตภัณฑ์แปรรูป ประมาณ 9000 เมตริกตัน ต่อปี มูลค่าการค้ารวมทั้งนำเข้าและส่งออกปี พ.ศ.2541 ประมาณ 450 ล้านบาท อย่างไรก็ตามประเทศไทยยังต้องนำเข้าพริกจากต่างประเทศ เนื่องจากพันธุ์พริกที่ปลูกในประเทศมีลักษณะที่ไม่เหมาะกับการแปรรูป มีปริมาณผลผลิตไม่เพียงพอ ซึ่งเป็นสาเหตุที่ทำให้ไทยยังมีการขาดดุลการค้าพริกอยู่จนถึงปัจจุบันนี้ อุปสรรคที่สำคัญในการผลิตพริกได้แก่ โรคและแมลงชนิดต่างๆ การศึกษาวิจัยเพื่อปรับปรุงพันธุ์พริกให้มีคุณลักษณะที่ต้องการจึงมีความสำคัญมาก

โรคที่สำคัญของพริกได้แก่โรคที่เกิดจากไวรัส จากเชื้อราแอนแทรคโนส และโรคที่เกิดจากเชื้อแบคทีเรียสาเหตุของโรคเหี่ยว การปรับปรุงพันธุ์พริกให้ต้านทานต่อโรคเหล่านี้เป็นแนวทางหนึ่งที่สามารถแก้ปัญหาศัตรูของพริก และเพิ่มผลผลิตได้ งานวิจัยนี้จึงได้ใช้เทคนิคพันธุวิศวกรรม ในการถ่ายยีนที่สามารถสร้างความต้านทานต่อไวรัสเข้าสู่พริกพันธุ์บางช้าง เพื่อทดลองและพัฒนาเทคนิคที่เป็นทางเลือกอีกทางหนึ่งในการปรับปรุงพันธุ์พริกให้ต้านทานต่อโรคไวรัส

วิธีการถ่ายยีนให้กับพริก

ยีนที่นำมาใช้สร้างความต้านทานให้กับพริก คือยีนที่ควบคุมการสังเคราะห์โปรตีนห่อหุ้มอนุภาคไวรัส หรือ coat protein gene ( ยีน CP ) ของไวรัสสาเหตุโรคใบด่างประ(Chilli vein banding mottle virus, CVbMV) ไวรัสชนิดนี้ก่อให้เกิดอาการใบด่าง ผลพริกบิดเบี้ยวหงิกงอ น้ำหนักผลลดลง สารพันธุกรรมของไวรัสเป็นสารประกอบชนิดอาร์เอ็นเอ มีความยาวประมาณ 10,000 นิวคลิโอไทด์ สำหรับยีน CP นั้นเป็นยีนส่วนหนึ่งของเชื้อไวรัสมีความยาวประมาณ 976 นิวคลิโอไทด์ หากนำเอายีน CP นี้มาตัดต่อสอดแทรกอยู่ในโครโมโซมของพริก พริกจะไม่เกิดโรคแต่จะเกิดกลไกการสร้างความต้านทานให้กับพืชได้

การทดลองเริ่มจากแยกเชื้อไวรัสสาเหตุโรคใบด่างประจากพริกที่เป็นโรคที่พบใน อ.กำแพงแสน จ.นครปฐม แล้วสกัดอาร์เอ็นเอออกจากอนุภาคของไวรัสเพื่อนำอาร์เอ็นเอของยีน CP ไปใช้เป็นต้นแบบพันธุกรรม ในการสังเคราะห์สายดีเอ็นเอคู่สม (CP-cDNA)ที่มีรหัสสอดคล้องกับยีน CP ของไวรัส โดยใช้เทคนิค Reverse transcriptase-Polymerase chain reaction (RT-PCR) นำสายดีเอ็นเอที่มีรหัสพันธุกรรมของยีน CP ขนาด 976 คู่เบส ตัดต่อเข้ากับดีเอ็นเอของพลาสมิดพาหะ pBI121 ที่ใช้ในการถ่ายยีนเข้าสู่พืช (หรือ plant vector) แล้วโยกย้ายพลาสมิดดีเอ็นเอสายผสมของ pBI121 และ ยีน CP เข้าสู่เซลล์ของ เชื้ออะโกรแบคทีเรีย เพื่อให้เชื้ออะโกรแบคทีเรียทำหน้าที่เป็นตัวกลางในการส่งถ่ายยีน CP ของไวรัสเข้าสู่โครโมโซมของพริก

พันธุ์พริกที่นำมาถ่ายยีน คือพริกชี้ฟ้า (Capsicum annuum) พันธุ์บางช้าง ซึ่งเป็นพันธุ์ที่เกษตรกรในจังหวัดราชบุรี และนครปฐม นิยมปลูก เป็นพริกทรงพุ่มเตี้ย ผลสุกสีแดงสด ผิวมัน ให้ผลผลิตสูง แต่อ่อนแอต่อโรคและแมลง เมื่อพริกพันธุ์นี้เป็นโรคที่เกิดจากเชื้อไวรัสใบด่างประ จะแสดงอาการใบด่าง ใบบิดเบี้ยว ลีบเล็ก ผลลีบบิดเบี้ยวและมีรอยด่างเห็นได้ชัด ผลมีน้ำหนักลดลงประมาณ 30 เปอร์เซ็นต์ ความเสียหายจากไวรัส CVbMV นี้เกิดจากการแพร่ระบาดอย่างง่าย ๆ ของเชื้อไวรัสไปกับเพลี้ยอ่อน ซึ่งจะดูดกินต้นพริกที่เป็นโรคและถ่ายทอดเชื้อไปยังพริกต้นอื่นได้ในเวลาเพียง 30 วินาที - 1 นาที เป็นอย่างต่ำ การใช้สารเคมีกำจัดเพลี้ยอ่อนจึงไม่มีประสิทธิภาพในการควบคุมโรคในแปลงปลูกพริกของเกษตรกร

การถ่ายยีน ทำในสภาพปลอดเชื้อโดยเพาะเมล็ดพริกให้งอกเป็นต้นกล้าที่มีใบเลี้ยงคู่แรก ใช้เวลาประมาณ 7-10 วัน จากนั้นตัดแบ่งครึ่งใบเลี้ยงของพริกแยกมาเพาะเลี้ยงในอาหารแข็ง 2 วัน จึงย้ายชิ้นใบมาแช่ในสารแขวนลอยเชื้ออะโกรแบคทีเรียที่มีพลาสมิดสายผสมของยีน CP แช่นานประมาณ 15-30 นาที เพื่อให้เชื้ออะโกรแบคทีเรียเกาะกับชิ้นใบ ครบเวลาแล้วย้ายชิ้นใบเลี้ยงวางบนอาหารแข็งเพื่อบ่มไว้กับเชื้ออะโกรแบคทีเรียนาน 2 วัน ซึ่งช่วงนี้เชื้อจะมีกระบวนการโยกย้ายถ่ายยีน CP เข้าสู่โครโมโซมพริกภายในเซลล์ของชิ้นใบพริก จากนั้นย้ายชิ้นใบมาเลี้ยงในอาหารเพาะเลี้ยงสูตรชักนำยอด ซึ่งเติมสารปฏิชีวนะกานามัยซิน สำหรับคัดเลือกเฉพาะเซลล์ของพริกที่ได้รับการถ่ายยีน เพาะเลี้ยงชิ้นใบเป็นเวลานาน 2-4 สัปดาห์ จะเกิดยอดเล็ก ๆ แล้วย้ายชิ้นใบที่พัฒนาเป็นยอดนี้วางบนอาหารยืดยอดนาน 2 สัปดาห์ ต่อด้วยอาหารชักนำราก และยืดราก อย่างละ 2 สัปดาห์ จนได้ต้นพริกที่สมบูรณ์ ย้ายต้นพริกที่มีใบจริงประมาณ 3 ใบ ปลูกลงดินและเก็บในโรงเรือนกระจกปรับแสงและอุณหภูมิ เพื่อให้พริกเจริญออกดอก ติดผล และเก็บเมล็ดเพื่อนำมาทดสอบความต้านทานต่อไวรัสต่อไป

ผลการถ่ายยีน และการคัดเลือกต้นพันธุ์พริก

ภายหลังการถ่ายยีน สามารถเพาะเลี้ยงชิ้นใบพริกให้พัฒนาเป็นต้นพริกที่สมบูรณ์ได้ จำนวนกว่า 200 ต้น นำใบพริกจากต้นพริกดัดแปรพันธุกรรมเหล่านี้มาวิเคราะห์ข้อมูลทางอณูชีววิทยาและทางพันธุศาสตร์บางประการ เพื่อคัดเลือกสายพันธุ์พริกที่ต้านทานต่อไวรัส ซึ่งเกษตรกรสามารถนำไปปลูกหรือภาคเอกชนสามารถนำไปใช้ในการปรับปรุงพันธุ์พริกต่อ ๆ ไปได้

วิธีการตรวจสอบเพื่อคัดเลือกต้นพริกที่ได้รับการถ่ายยีน (R0)

1. ใช้เทคนิค Genomic DNA Southern hybridization เพื่อตรวจสอบยีน CP หรือยีนคัดเลือก (ในที่นี้คือยีน npt II ซึ่งทำให้เซลล์พืชทนต่อสารกานามัยซินได้) ที่อยู่บนโครโมโซมพริก

2. เทคนิค PCR เพื่อตรวจสอบยีน CP หรือยีนคัดเลือก บนโครโมโซมพริก

3. เทคนิค ELISA และ/หรือ western blot เพื่อตรวจสอบสารสังเคราะห์จากยีน CP ของไวรัสในพริก

ในงานวิจัยนี้ตรวจพบว่ามียีน CP สอดแทรกอยู่ในโครโมโซมพริกที่ดัดแปรพันธุกรรมได้จำนวน 24 ต้น จากพริกที่เพาะเลี้ยงได้ภายหลังการถ่ายยีน จำนวน 220 ต้น

การทดสอบความต้านทานต่อไวรัส CVbMVของพริกดัดแปรพันธุกรรมที่เป็นเมล็ดพริกรุ่นลูก

เลือกเก็บผลพริกจากดอกที่ผสมตัวเองของต้นพริกดัดแปรพันธุกรรม ต้นละ 3-5 ผล แล้วเพาะกล้าให้มีใบจริง 5-7 ใบ ปลูกเชื้อไวรัส CVbMV โดยการทาน้ำคั้นที่มีไวรัสบนใบพริกทุกใบ สังเกตอาการบนต้นพริกดัดแปรพันธุกรรม รุ่นลูก นาน 90 วัน ตรวจนับอัตราต้นที่ต้านทานโรค โดยดูจากอาการ แล้วตรวจสอบปริมาณไวรัสภายในต้นด้วยเทคนิคทางซีรั่มวิทยา เพื่อศึกษาอิทธิพลของยีน CP ในการสร้างความต้านทานต่อไวรัสให้กับพริก พบว่ามีพริกดัดแปรพันธุกรรมรุ่นลูกชั่วที่ 1 จำนวน 1 สายพันธุ์คือ line # 161-1 ให้พริกรุ่นลูกชั่วที่ 2 ที่มีความต้านทานต่อโรคอัตราสูงถึง 100 เปอร์เซ็นต์ และเมื่อเก็บเมล็ดจากต้นพันธุ์เหล่านี้ไปทดสอบความต้านทานต่อไวรัส พบว่าพริกดัดแปรพันธุกรรมเหล่านี้มีความต้านทานต่อไวรัส ซึ่งแสดงให้เห็นว่าลักษณะความต้านทานต่อไวรัสมีการถ่ายทอดลักษณะไปยังรุ่นลูกต่อไปอีกอย่างน้อย 2 รุ่น

การตรวจสอบยีน CP และยีนคัดเลือก nptII ในพริกดัดแปรพันธุกรรมที่เป็นรุ่นลูก

ใช้เทคนิค PCR และ nucleic acid hybridization ตรวจสอบยีนทั้งสองชนิด แล้วคำนวณอัตราการตรวจพบยีนในพริกรุ่นลูกชั่วที่ 1 เพื่อวิเคราะห์ลักษณะการถ่ายทอดพันธุกรรม ซึ่งจะเป็นข้อมูลประกอบในการคัดเลือกพริกที่ได้รับการถ่ายยีนสำหรับพัฒนาให้เป็นพันธุ์แท้ต่อไป จากการทดลองและวิเคราะห์พบว่า สายพันธุ์พริกดัดแปรพันธุกรรม line # 161-1 มียีน CP และ npt II สอดแทรกอยู่ในโครโมโซม และมีความเหมาะสมที่จะนำไปพัฒนาเป็นพันธุ์แท้ต่อไปได้

การศึกษาลักษณะทางพืชสวนของพริกดัดแปรพันธุกรรม

ทำการเปรียบเทียบลักษณะของพริกบางช้างพันธุ์เดิมก่อนถ่ายยีนและสายพันธุ์ที่ดัดแปรพันธุกรรมแล้ว โดยปลูกพริกดังกล่าวในกระถางที่มีถาดรองและใช้น้ำหยด ภายในโรงเรือนตาข่ายที่เป็นระบบปิด การทดสอบในขั้นตอนนี้ ได้ขออนุญาตจากคณะกรรมการความปลอดภัยทางชีวภาพของมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ ถูกต้องตามข้อกำหนด เก็บข้อมูลทางพืชสวนของพริกแต่ละสายพันธุ์ เช่น ระยะเวลาออกดอก ดอกบาน ทรงพุ่ม ความสูงของต้น สีและขนาดผล และผลผลิตต่อต้น ผลการศึกษาพบว่าลักษณะต่าง ๆ ของพริกบางช้างก่อนและหลังการถ่ายยีนไม่มีความแตกต่างกัน

ข้อมูลจากผลการทดสอบข้างต้นทั้งหมดนี้ชี้ให้เห็นว่าการถ่ายยีนให้กับพริกพันธุ์บางช้างสามารถช่วยในการปรับปรุงพันธุ์พริกให้มีลักษณะความต้านทานต่อไวรัส CVbMV สาเหตุโรคใบด่างประของพริกได้ และการที่คัดเลือกสายพันธุ์พริกที่มีความต้านทานต่อโรคได้หนึ่งสายพันธุ์ ขี้ให้เห็นว่าการถ่ายยีนเพื่อผลิตพืชพันธุ์ต้านทานโรคต้องทำในปริมาณมากกว่าที่ทำในการทดลองนี้หลายเท่า จึงจะได้สายพันธุ์พริกดัดแปรพันธุกรรมในปริมาณมาก เพื่อนำมาคัดเลือกไว้เป็นต้นพันธุ์ที่ดีสำหรับใช้ในการปรับปรุงพันธุ์ต่อไป

สรุป

การศึกษาทดลองถ่ายยีน CP เพื่อสร้างความต้านทานต่อไวรัสให้กับพริกพันธุ์บางช้าง มีวัตถุประสงค์หลักที่จะพัฒนาเทคนิคที่เหมาะสมกับการถ่ายยีนให้กับพริก ซึ่งหากต้องการนำเทคนิคดังกล่าวไปใช้ในพริกพันธุ์อื่น หรือต้องการถ่ายยีนชนิดอื่น ก็จะทำได้โดยปรับใช้ข้อมูลจากงานทดลองครั้งนี้ อย่างไรก็ตามการจะนำพริกที่ได้รับการดัดแปรพันธุกรรมและคัดเลือกแล้วไปปลูกในสภาพธรรมชาติหรือในแปลงของเกษตรกรจำเป็นต้องขออนุญาตจากหน่วยงานราชการที่กำกับดูแลงานทดลองเกี่ยวกับพืชดัดแปรพันธุกรรม ก่อนทำการศึกษาทดลองด้านความปลอดภัยทางชีวภาพ และด้านอาหาร เพื่อให้มั่นใจว่าผู้ผลิต ผู้บริโภค รวมทั้งสภาพแวดล้อม จะไม่ได้รับผลเสียจากการนำเทคโนโลยีชีวภาพด้านพันธุวิศวกรรมมาใช้ประโยชน์เพื่อพัฒนาการเกษตรของไทย

บรรณานุกรม

พิสสวรรณ เจียมสมบัติ สุพัฒน์ อรรถธรรม นุชนาถ แซ่อึ้ง สุจินต์ ภัทรภูวดล ถวัลย์ศักดิ์ เผ่าสังข์

เธชเธธเน€เธ—เธงเธต ศุขปราการ สุภาภรณ์ เอี่ยมเข่ง และ อัญจนา บุญชด. 2542. การปรับปรุงพริกพันธุ์ บางช้างให้ต้านทาน

ต่อไวรัสด้วยเทคนิคการถ่ายยีน. การประชุมทางวิชาการเกษตรแห่งชาติครั้งที่ 37 วันที่ 3-5 กุมภาพันธ์ 2542. มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ กรุงเทพฯ.

สุภาภรณ์ เอี่ยมเข่ง พิสสวรรณ เจียมสมบัติ สุจินต์ ภัทรภูวดล และ สุพัฒน์ อรรถธรรม. 2542.

การคัดเลือกพริกบางช้างจำลองพันธุ์ที่ต้านทานต่อไวรัสเส้นใบด่าง

การประชุมเทคนิคของวิธีการทางวิทยาศาสตร์ชีวภาพ ครั้งที่ 13.

ฝ่ายปฏิบัติการวิจัยและเรือนปลูกพืชทดลอง สถาบันวิจัยและพัฒนาแห่งมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ วิทยาเขตกำแพงแสน นครปฐม.

Negrutiu,I.1995. Analysis of transgenic plants.In Potrykus, I, and Spangenberg,G.(eds.).

Gene transfer to plants. Springer-verlag.Berlin-Hiedelberg, Germany. pp.217-258.

Siriwong,P., Kittipakorn,K., and Ikegami,M. 1995. Characterization of chilli vein

banding mottle virus isolated from pepper in Thailand. Plant Pathol 44: 718-727.

Kasetsart University of Thailand

หน้าแรก || ค้นหาข้อมูล || ติดต่อ
Copyright (C) 2002. Kasetsart University
Revised : June, 2002
Contact WebMasTeR of Kasetsart University